محمدعلي عليخاني مركز تحقيقات بيولوژي مولکولي دانشگاه علوم پزشكي بقيها... تهران ايران

Iranian Journal of Military Medicine Vol. 14, No. 1, Spring 2012 Pages: 49-55 مجله طب نظامی دوره ۴ شماره بهار ۳۹ صفحات: ۴۹-۵۵ Downloaded from militarymedj.ir at 23:19 +0430 on Saturday August 18th 2018 ۲ * BSc رضا گلمحمدي PhD ناصر صفايي PhD رضا کچوي ي MSc محمدعلي عليخاني مركز تحقيقات بيولوژي مولکولي (عج) دانشگاه علوم پزشكي بقيها... تهران ايران (عج) مركز تحقيقات بيولوژي مولکولي دانشگاه علوم پزشكي بقيها... تهران ايران ۲ گروه بيماريهاي گياهي دانشكده كشاورزي دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران * چکيده اهداف: سم ۲-T سميترين تريکوتسن است و اغلب توسط فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس توليد ميشود. اين مايکوتوکسين محصولات کشاورزي و بهويژه غلات را ا لوده نموده و ميتواند سبب بيماريهاي شديد و حتي مرگ در انسان شود. در مسير بيوسنتز سم ۲-T ژن Tri۶ اسيلترانسفرازي را کد ميکند که تشکيل گروه جانبي استر را در کربن شماره ۸ کاتاليز ميکند. هدف اصلي اين مطالعه طراحي روش مولکولي براساس ژن Tri۶ بهمنظور شناسايي فوزاريومهاي مولد سم ۲-T بود. روشها: در اين مطالعه از نوع تجربي تعداد سويه فوزاريوم (شامل ۲۲ سويه استاندارد و ۸۹ ايزوله فوزاريوم) مورد بررسي قرار گرفت. پس از خالصسازي سويهها و تهيه كشت انبوه در محيط پ تيتود كستروزبراث (PDB) استخراج DNA ا نها با استفاده از نيتروژن مايع و با كمك بافرهاي ليزکننده و محلولهاي فنل- کلروفرم- ايزوا ميلالکل (PCI) صورت گرفت. با استفاده از پرايمرهاي طراحيشده و انتخابي براساس ژن Tri۶ و بهينهنمودن PCR اين ژن در تمام سويههاي مولد و غيرمولد سم ۲-T رديابي شد. يافتهها: تمام ايزولههاي فوزاريوم مولد سم ۲-T شامل ۴ ايزوله فوزاريوم اسپوروتريکوي يدس يک گونه فوزاريوم پوي ه و يک گونه فوزاريوم لانگستيه محتوي قطعه ژن (۳۸۰ Tri۶ جفت باز) بودند. نتيجهگيري: با پروتکل مولکولی طراحیشده براساس ژن Tri۶ ميتوان گونههاي مهم مولد سم ۲-T مانند فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس لانگستيه را شناسايي کرد. همچنين ميتوان گونههايي از فوزاريوم كه بهطور ضعيف مولد ۲-T هستند را نيز شناسايي نمود. کليدواژهها: فوزاريوم مايكوتوكسين ۲-T تريکوتسن ژن Tri۶ واكنش زنجيرهاي پليمراز (PCR) و فوزاريوم Detection and tracing of Tri16 gene in T-2 toxigenic and nontoxigenic Fusarium species by PCR Alikhani M. A. 1 MSc, Kachuei R.* PhD, Safaei N. 2 PhD, Golmohammadi R. 1 BSc Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran 1 Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran 2 Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran Abstract Aims: T-2 mycotoxin is the most toxic trichothecene produced by Fusarium species especially Fusarium sporotrichioides. This species is the contaminant of cereal grains that can cause severe diseases among humans and animals and it may lead to death. Tri16 gene encodes an acyltransferase that catalyzes the formation of ester side groups at C-8 in biosynthesis pathway of T-2 toxin. The aim of the present study was to design a molecular method for identification of Fusarium species based on Tri16 gene, capable of producing T-2 toxin. Methods: In this experimental study, the DNA of 111 T-2 producing and nonproducing Fusarium strains (including 89 Fusarium isolates and 22 standard Fusarium spp.) were evaluated. After purifying the strains and preparing the cultures in Potato Dextrose Broth (PDB), the DNA was extracted using liquid Nitrogen and lysing buffers and by Phenol, Chloroform and Isoamyl alcohol (PCI) solutions. The gene was detected in all T-2 producing and nonproducing strains using the designed and selected primers based on Tri16 gene and PCR optimization. Results: All T-2 toxin producing Fusarium strains including Fusarium sporotrichioides (4 species), Fusarium langsethiae (1 species) and Fusarium Poae (1 species) contained the Tri16 gene fragment (1380 bp). Conclusion: Important T-2 toxin producing species such as Fusarium sporotrichioides and Fusarium langsethiae could be identified with the designed molecular protocol designed based on Tri16 gene. In addition, weakly T-2 producing species can be identified with this method. Keywords: Fusarium, T-2 Mycotoxin, Trichothecene, Tri16, Polymerase Chain Reaction (PCR). kachueir@gmail.com. : 90/11/8 : 90/5/23 :

۵۰ محمدعلي عليخاني و همكاران مقدمه تريکوتسنها از نظر تنوع و گستردگي مهمترين گروه از مايکوتوکسينها هستند بهطوری که بيش از ۵۰ نوع تريکوتسن شناسايي شده است [ ۲]. سم ۲-T يك تريکوتسن با سميت بسيار بالاست که سميت ا ن ۰ برابر سميت دياکسينيوالنول (DON) است. اين توكسين ۰۰ بار بيشتر از خردل پوست را تحت تاثير قرار ميدهد. همچنين مقاوم به حرارت بوده و بها ساني در اثر اتوکلاو از بين نميرود [ ۳]. اين مايکوتوکسين که بهدليل داشتن اثر سايتوتوکسيتي و سركوبكنندگي سيستم ايمني براي سلامت انسان و حيوانات مضر است از دو جنبه اصلي اهميت دارد: - ا لودهکننده محصولات کشاورزي بهويژه غلات بوده و بهعنوان مشکل جدي بهداشت مواد غذايي مطرح است و موجب مسموميت شديد بهصورت حاد يا مزمن در انسان و حيوانات اهلي میشود و حتي ممکن است منجر به مرگ شود بهطوري که اپيدميهاي متعدد ا ن در انسان و حيوانات گزارش شده و جان هزاران نفر را گرفته است [۲ ۴ ۹]. ۸ ۷ ۶ ۵ اين سم طيفي از علايم باليني را در بيمار مسموم ايجاد ميکند که مهمترين ا ن الوکياي سمي گوارشي (ATA) است. اين بيماري در انسان بسيار وخيم و حاد و در اکثر موارد كشنده است. مهمترين علايم اين بيماري شامل لکوپني شديد خونريزيهاي متعدد زيرپوستي ضايعات نکروتيک تحليل و تخليه مغز استخوان نکروز پوستي ا لودگي خون به توكسين و علايم گوارشي اعم از تهوع استفراغ درد شکم اسهال و غيره است [۹]. ۲- اين سم بهعنوان عامل و سلاح بيولوژيک مطرح است. گزارشات مستندي مبني بر استفاده از اين عامل بهصورت سلاح بيولوژيک (باران زرد) توسط شوروي سابق طي سالهاي ۹۷۴ تا ۹۸ در لاي وس کامبوج و افغانستان و ديگر جنگها مانند جنگ ايالات متحده و ويتنام وجود دارد که باعث توجه بينالمللي شده است. گزارشات تاييدنشدهاي نيز در استفاده از اين سم در جنگ تحميلي ايران و عراق و ديگر جنگها وجود دارد که حايز اهميت است [۳ ۰]. گونههاي فوزاريوم بهدليل اهميتشان در پزشکي بهداشت و کشاورزي از مهمترين گروههاي قارچي محسوب ميشوند. ا نها طيفي از مايکوتوکسينها را توليد ميکنند که سبب ا لودگي مواد غذايي ميشوند []. فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس مهمترين گونه فوزاريوم مولد تريكوتسنهاي گروه A بهويژه سم ۲-T است []. فوزاريوم لانگستيه ديگر گونه مهم مولد سم ۲-T است كه طي سالهاي اخير از شمال مركز و شرق اروپا گزارش شده است [۲ ۵ ۴ ۳ ۶]. ايزوله ا تيپيك فوزاريوم لانگستيه نيز اخير ا از ايران معرفي شده است [۷ ۸]. اين مايكوتوكسين بهندرت توسط ديگر گونههاي فوزاريوم گزارش شده است. از جمله اين گونهها فوزاريوم پوي ه است كه بهطور ضعيف مولد سم ۲-T است [ ۹]. شناسايي گونههاي فوزاريوم هميشه برای قارچشناسان مشکل بوده است. روشهاي معمول که برای تشخيص و شناسايي فوزاريومها بهکار ميرود براساس خصوصيات مورفولوژيکی قارچ (چه از نظر شکل کلني روي محيطهاي کشت ا گاردار و چه از جهت خصوصيات ميکروسکوپي اعم از شکل و اندازه ماکروکونيدي و وجود يا عدم وجود ميکروکونيدي و کلاميدوسپورها) است که نياز به صرف زمان زحمت زياد و نيروي متخصص دارد و قارچشناسان اغلب برای تشخيص گونههايي که مورفولوژي مشابه دارند با مشکلاتي مواجه هستند []. همچنين شناسايي مورفولوژيكي گونههاي مولد توكسين كاری بسيار سخت و احتما لا نشدني است. از طرفي در حال حاضر برای شناسايي اين سم روشهاي مختلفي وجود دارد که از ا ن جمله ميتوان به روشهاي بيوشيميايي مانند کروماتوگرافي با لايه نازک (TLC) گازکروماتوگرافي GC-MS) (GC-FID روش کروماتوگرافي مايع با کارکرد عالي (HPLC) HPLC-MS و بيو اس ي (الايزا) اشاره کرد که نياز به تکنيکها تجهيزات و امکانات هزينهبر و وقتگير دارد.[۲۶ ۲۵ ۲۴ ۲۳ ۲۲ ۲ ۲۰ ۳] استفاده از روشي که بتواند قارچ توکسينزا را سريع ا شناسايي نمايد اهميت بسزايي دارد. روشهاي مولکولي مثل PCR روشهاي حساس سريع دقيق و مطمي ن در تشخيص گونه هستند [۲۷]. روشهاي مولكولي از جهات مختلفي مانند شناسايي فوزاريومهاي توكسينزا شناسايي فوزاريومهاي عامل پاتوژن گياه يا سيستماتيك قارچي مورد استفاده قرار گرفتهاند [۲۸ ۲۹]. ژنهاي مسير بيوسنتز تريكوتسنها در فوزاريومها مشابه بسياري از ژنهاي مسير بيوسنتز ا نتيبيوتيكها و ديگر توكسينها خوشه ژني را تشكيل ميدهند كه اين خوشه ژني در حال شناسايي است. در اين خصوص و بهويژه در مورد مسير بيوسنتز ۲-T در فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس مطالعاتی بهطور گسترده صورت گرفته است و ژنهاي متعددي شامل Tri۵ Tri۲ Tri Tri۶ Tri۴ Tri۵ Tri۳ Tri۰ و غيره كه هر كدام مسي ول سنتز گروه عامل يا تنظيمكننده در ساختمان سم ۲-T هستند مورد مطالعه قرار گرفتهاند ].[۳۴ ۳۳ ۳۲ ۳ ۳۰ در مسير بيوسنتز سم T-۲ ژن Tri۶ اسيلترانسفرازي را کد ميکند که موجب استريفيهشدن کربن شماره ۸ ساختمان تريکوتسني میشود که وجود ا ن در ساختار ۲-T ضروري است [۳۵]. هدف از مطالعه حاضر طراحي روش مولکولي (PCR) براساس ژن Tri۶ به منظور شناسايي فوزاريومهاي مولد سم ۲-T بود. روشها سويههاي مورد استفاده: تعداد سويه فوزاريوم مولد و غيرمولد سم ۲-T (شامل ۲۲ سويه استاندارد و ۸۹ ايزوله) مورد بررسي قرار گرفت. ايزولههاي مورد مطالعه از غلات مناطق مختلف ايران در مطالعات قبلي جدا شده بود [۷]. سويههاي مولد سم ۲-T كه در مطالعات قبلي (كچويي و همكاران دادههاي منتشرنشده) مورد دوره ۴ شماره بهار ۳۹ مجله طب نظامي

ا ناليز قرار گرفته بودند شامل سويههای فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس (۴ سويه) گونه ا تيپيك فوزاريوم لانگستيه (يک ايزوله) و فوزاريوم پوي ه (يك سويه) بودند (جدول ). رديف جدول ) سويهها و ايزولههاي مولد سم ۲-T نام گونه محل جداسازي ۵ فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس (10329 (BBA فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس (72014-D (VTT فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس (4333 (MCR فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس (0043 (MCR ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ فوزاريوم لانگستيه (ايزوله ا تيپيك) فوزاريوم پوي ه (8486 (MCR ا لمان فنلاند ا فريقاي جنوبي ا فريقاي جنوبي ايران ا فريقاي جنوبي لازم به ذكر است كه گونه فوزاريوم لانگستيه مورد استفاده از نظر مورفولوژي و توالي ژن ITS مشابه فوزاريوم لانگستيه بود اما از نظر توالي قطعه ژن EF1α مشابه فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس بود به همين دليل در مورد ا ن لفظ ا تيپيك بهكار برده شده است. شناسايي گونهها: سويههاي مورد بررسي بهروش مورفولوژي و مولكولي در مطالعات قبلي مورد شناسايي قرار گرفته بودند [۷]. روش استخراج :DNA استخراج DNA بهروش فنل- كلروفرم مطابق با روش چوي ي و همكاران [۳۶] و رضايي و همكاران [۳۷] البته با كمي تغيير انجام شد كه بهطور خلاصه به اين صورت بود ابتدا از فوزاريوم در محيط كشت پتيتود كستروزبراث (PDB) بهمدت ۴ تا ۶ روز کشت انبوه تهيه شد و سپس با بافر PBS شستشو داده شد. بعد از ا ن ميسليوم قارچ توسط نيتروژن مايع فريز و پودر شد و سوسپانسيونی از ميسليوم پودرشده با بافر ليزکننده DNA تهيه شد. سپس به ا ن پروتي يناز k و %۰ SDS افزوده شد و در بنماري ۶۵ درجه سانتيگراد نگهداري شد. در مرحله بعد فنل- كلروفرم- ايزوا ميلالكل (PCI) بهترتيب به نسبت :۲۴:۲۵ و همچنين كلروفرم- ايزوا ميلالكل (CI) به نسبت :۲۴ افزوده شد و سانتريفيوژ ۲ هزار دور بر دقيقه بهمدت ۰ دقيقه صورت گرفت و محلول رويي جدا شد. سپس محلول استاتسديم ۳ مولار (بهميزان ۳ ميكروليتر) و الكل مطلق سرد افزوده شد و به فريزر ۲۰- درجه سانتیگراد انتقال يافت. بعد از ا ن اتانول %۷۰ (بهميزان ۲۰۰ ميكروليتر) اضافه شد و DNA رسوبنموده در ۲۰ ميكروليتر بافر TE حل شد. در مرحله ا خر نيز DNA روي ژل ا گاروز % برده شد و با رنگا ميزي با اتيديومبرومايد DNA روي ژل مشاهده شد. PCR و تعيين توالي: واکنش PCR در حجم نهايي ۲۵ ميكروليتر انجام گرفت. واكنش شامل ۲/۵ ميكروليتر مستر ميكس (محتوي بافر dntp ا نزيم Taq DNA polymerase و (MgCl ۲ ۰/۵ ميكروليتر DNA الگو /۵ ميكروليتر از هر كدام از پرايمرهاي طراحيشده و انتخابي Tri۶F و Tri۶R مطابق جدول [۳۵] ۲ و ۹ ميكروليتر ا ب مقطر تزريقي بود. نحوه انجام :PCR واسرشت ابتدايي در ۹۴ درجه سانتيگراد بهمدت ۵ دقيقه ۳۵ دور از واسرشت (۹۴ درجه سانتيگراد بهمدت ۳۰ ثانيه) اتصال (۶۰ درجه سانتيگراد بهمدت ۴۵ ثانيه) و گسترش (۷۲ درجه سانتيگراد بهمدت يك دقيقه و ۲۰ ثانيه) و در ادامه گسترش نهاي ي (۷۲ درجه سانتيگراد بهمدت ۷ دقيقه) انجام شد. بهمنظور پيداکردن بهترين دماي اتصال PCR بهصورت گراديانت از ۵۵ درجه سانتيگراد تا ۶۵ درجه سانتيگراد گذاشته شد و نتيجتا دماي ۶۰ درجه سانتيگراد انتخاب شد. پرايمر جدول ۲) توالي پرايمرهاي Tri۶F و Tri۶R توالي 5 ' -GCCCTTTCTAGATGCCTGAG-3 ' Tri۶F 5 ' -TTGGTTGCCTCCGTCTTGG-3 ' Tri۶R مطابق با واكنش و نحوه انجام PCR قطعه ژن Tri۶ در تمام ايزولهها و سويههاي استاندارد فوزاريوم رديابي شد. سپس محصول PCR بهدستا مده (تقريبا ۳۸۰ جفت باز) در مورد گونههاي فوزاريوم پوي ه (8486 (MCR و فوزاريوم لانگستيه (ا تيپيك) از روي ژل استخراج و تعيين توالي شد. تواليهاي بهدستا مده با استفاده از نرمافزار Mega 5 و روش دستي در كنار ركوردهاي ثبتشده در بانك اطلاعات ژني (NCBI) در خصوص ژن Tri۶ مربوط به فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس همرديف شدند. شکل ) رديابي قطعه ژن (۳۸۰ Tri۶ جفت باز) در تعدادي از سويههاي استاندارد و ايزولههاي فوزاريوم مورد بررسي. M: مارکر. چاهک تا ۴: فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس بهترتيب MCR 4333 VTT D-72014 BBA 10329 و.MCR 0043 چاهک :۵ فوزاريوم پوي ه.MCR 8486 چاهک :۶ ايزوله فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک. چاهک ۷: فوزاريوم پوي ه.MCR 8485 چاهک ۸ تا : فوزاريوم گرامينه ا روم بهترتيب MCR 6010 MCR 4712 و ايزولهها. چاهک ۲: فوزاريوم پروليفراتوم MCR 8549 چاهک ۳: فوزاريوم ورتيسيليوي يدس.MCR 8560 چاهک ۴: کنترل منفي. Ir J Military Medicine Vol. 14, No. 1, Spring 2012

۵۲ محمدعلي عليخاني و همكاران جدول ۳) توالي بخشي از ژن (۳۸۰ Tri۶ گونه فوزاريوم فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس به شماره دسترسي AY187275 جفت باز) حاصل از فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس پوي ه MCR 8486 (وسط) و فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک (پايين) گرفتهشده از بانک ژني به شماره دسترسي AY187275 توالي ژن Tri۶ (بالا) فوزاريوم ATGGCCCTTTCTAGATGCCTGAGAACTAGAACAGCGTTCCTCTCTCCCCTTGACCAATTAAACTCT TCATTTTACATTCGCTGGTCCTTAGTGTTACATGCCAAGGATCGTGACAAAGCTGTCAATCGCCTG TCGAAAGGGTTAAATGCTGTTACATCAAAGCTGCCATTCCTCAAAGGGCGAATCAACTACCATAC GGACACCGCCAACAACAAGATAGCCTCTGCTTCACGGGCTGTTATTTCCATGTCAGACGATAGTCC GAATCTATCATTACGAGAACTACGCCCAGCAAAGGAACTACCCAGCTTAGCAAGGATCAAGCAAC AGGGTGCACCATCCCACCTTTTCACAGACGATCTATACTCGTTGCCTATCTTTATAGATACCACAT CGAAGCAATCTCACCCAGTATTAAAAACAACCTATGCTCCTATCGAGGGAGGCCTGATACTTAAC ATATGCGTTCACCATGGTGTTATGGACGGCCAAGGACTTGCGACGTTGACTGATCTATGGGCCTCG TTCACCCGTCAGCAAGACCAAAACGAAAACGAGGTGCAGCAGCCGAAGAACCTTCCCGATCCCGA TGAGCCTCTTACACGAACGGCCAGACTTGCTACAGCTATAAATGCCACAGCAGACCCTGAGATTA CCGATATCGAAACAAGTCTCCAGCGTTATCGAAACGATAGGATACTCGAACAAAACATCGCTGCA TCGACAGGGGACAGCAGGAAAAAGACAAGCAGGATATTCGCATTTTCAAGCAACAAGCTCAAGG ACGCGAAAGAAGTTTTGGCAAATAACGGCTGCCATGTCACGACAAACTCGATCTTAAATGCTGCG GTCTGGTCTAATCTTACACGTGTACGTCTATCACGCCGGACGCAGCTGCCACCAACACCATTCGCG CGATTTACCCAAATGGTAGATGGTAGACGACAATTACTTCCAAAAATCAACAAGCCGGGGCCTTA TATGGGTAATGTCGTGCTTACATCGTCGGCTGATGTTTCACTTGATACATTGGTGGCGACTGGCTTT TTCAACTATCTGTCAGTCTCTCTGATGGCCCCAGTAGCGCAGGCCATATACGATGCATCAAGAAAA GTTACTACGGAATACATTGATGGCTTCTTGAAAACCCTGCAAAAAGTAGATGACCCCGCAAGCCT CGGCATAGGGAGTATGAGTCAGCATGGGGTCGACTTCATTTCAACAAGTGTTGCAAATGCACCAT TCTACGAATGTGACTTTGGGCCATCGCTTAGCGAAGATTCTGCTGGCGGAAAGGAGGGCAAGCCA GTCTTTGTGCGGTATCCGTATATTGATTGGGCCGATGGCAACATGATATTGCTGCCAAGACGGAGG CAACCAACTGAAAACGATGAGACCATTGAAGCATATATTATGTTAGCAGAGGATGATTTGGTAGC TTTGGCGGAGGATCCTGGGTTTTGTAGTTGGCTGAAAGAGTAA TGACNATTNAACTCTTCATTTTACATTCGCTGGTCCTTGGTGTTACACGCCAAGGATCGTGACAAA GCTGTCAATCGCCTATCGAAAGGGTTAAATGCTGTTACATCAACGCTGCCATTCCTCAAAGGGCGA ATCAACTACCATACGGACAACGCCAACAACAAGATAGCCTCTGCTTCACGGGCTGTTATTTCCATG TCAGACGATAGTCCGAATCTATCATTACGAGAACTACGCCCAGCAAAGGAACTACCCAGCCTAGC AAGGATCAAGCAACAGGGTGCACCATCCCACCTTTTCACAGACGATCTATACTCGTTGCCTATCTT TATAGATACCACATCGAAGCAATCTCACCCAGTATTAAAAACAACCTATGCTCCTATCGAGGGAG GCCTGATACTCAACATATGCGTTCACCATGGTGTTATGGACGGCCAAGGACTTGCGACGTTGACTG ATCTATGGGCCTCGTTCACCCGTCAGCAAGACCAAAACGAAAACGAGGTGCAGCAGCCGAAGAA CCTTCCCGATCCCGATGAGCCTCTTACACGAACGGCCAGACTTGCTACAGCTATAAATGCCACAGC AGACCCTGAGATTACCGATATCGAAACAAGTCTCCAGCGTTATCGAAACGATAGGATACTCGAAC AAAACATCGCTGCATCGACAGGGGACAGCAGGAAAAAGACAAGCAGGATATTCGCATTTTCAAG CAACAAGCTCAAGGACGCGAAAGAAGTTTTGGCAAATAACGGCTGCCATGTCACGACAAACTCGA TCTTAAATGCTGCGGTCTGGTCTAATCTTACACGTGTACGTCTATCACGCCGGACACAGCTACCAC CAACACCATTCGCGAGATTTACCCAAATGGTAGATGGTAGACGACAATTACTTCCAAAAATCAAC AAGCCCGGGGCCCTTATATGGGTAATGTCGTGCTTACATCGTCGGCTGATGTTTCACTTGATACAT TGGTGGCGACTGGCTTTTTCAACTATCTGTCAGTCTCTCTGATGGCCCCAGTAGCGCAGGCCATAT ACGATGCATCCANAAAAGTTACTACGNATACATTGATGGCTTCTTGAAAACCCTGCGAAAAGTAG ATGACCCCGCAAGCCTTGGCATAGGGAGTATGAGCCAGCATGGGGTCGACTTCATTTCAACAAGT GTTGCAAATGCACCATTC TTGACNATTAAACTCTTCATTTTACATTCGCTGGTCCTTGGTGTTACACGCCAAGGATCGTGACAA AGCTGTCAATCGCCTGTCGAAAGGGTTAAATGCTGTTACATCAAAGCTACCATTCCTCAAAGGGC GAATCAACTACCATACGGACAACGCCAACAACAAGATAGCCTCTGCTTCACGGGCTGTTATTTCC ATGTCAGACGATAGTCCGAATGTATCATTACGAGAACTACGCCCAGCAAAGGAATTACCCAGCCT AGCAAGGATCAAGCAACAGGGTGCACCATCCCACCTTTTCACAGACGATCTATACTCGTTGCCTAT CTTTATAGATACCACATCGAAGCAATCTCACCCAGTATTAAAAACAACCTATGCTCCTATCGAGGG AGGCCTGATACTCAACATATGCGTTCACCATGGTGTTATGGACGGCCAAGGACTTGCGACGTTGA CTGATCTATGGGCCTCGTTCACCCGTCAGCAAGACCAAAACGAAAACGAGGTGCAGCAGCCGAAG AACCTTCCCGATCCCGATGAGCCTCTTACACGAACGGCCAGACTTGCTACAGCTATAAATGCCACA GCAGACCCTGAGATTACCGATATCGAAACAAGTCTCCAGCGTTATCGAAACGATAGGATACTCGA ACAAAACATCGCTGCATCGACAGGGGACAGCAGGAAAAAGACAAGCAGGATATTCGCATTTTCA AGCAACAAGCTCAAGGACGCGAAAGAAGTTTTGGCAAATAACGGCTGCCATGTCACGACAAACTC GATCTTAAATGCTGCGGTCTGGTCTAATCTTACACGTGTACGTCTATCACGCCGGACACAGCTACC ACCAACACCATTCGCGAGATTTACCCAAATGGTAGATGGTAGACGACAATTACTTCCAAAAATCA ACAAGCCCGGGGCCTTATATGGGTAATGTCGTGCTTACATCGTCGGCTGATGTTTCACTTGATACA TTGGTGGCGACTGGCTTTTTCAACTATCTGTCAGTCTCTCTGATGGCCCCAGTAGCGCAGGCCATA TACGATGCATCAAGAAAAGTTACTACGGAATACATTGATGGCTTCTTGAAAACCCTGCGAAAAGT AGATGACCCCGCAAGCCTTGGCATAGGGAGTATGAGCCAGCATGGGGTCGACTTCATTTCAACAA GTGTTGCAAATGCACCATTCTACGAATGTGACTTTGGGCCATCGCTTAGCGAAGATTCTGCTAGCG GAAAGGAGGGCAAGCCAGTCTTTGTGCGGTATCCGTATATG فوزاريوم پوي ه MCR 8486 فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک دوره ۴ شماره بهار ۳۹ مجله طب نظامي

نتايج شکل رديابي قطعه ژن Tri۶ (تقريب ا ۳۸۰ جفت باز) را در تعدادي از سويههاي استاندارد و ايزولههاي فوزاريوم مورد مطالعه نشان ميدهد. از تعداد ۸۹ ايزوله فوزاريوم فقط فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک واجد قطعه ژن Tri۶ بود. از ۲۲ سويه استاندارد ۵ سويه شامل ۴ سويه فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس و يک سويه فوزاريوم پوي ه واجد ژن Tri۶ بودند که سم ۲-T توليد میکردند. توالي قطعه ژن Tri۶ مربوط به فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس گرفتهشده از بانک ژني به شماره دسترسي AY187275 همچنين نتيجه توالي قطعه ژن Tri۶ مربوط به ايزوله فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک و سويه فوزاريوم پوي ه (8486 (MCR در جدول ۳ ا ورده شده است. بحث در اين مطالعه پرايمرهاي انتخابي و طراحيشده علاوه بر اينکه توانستند قطعه ژن Tri۶ را در ۴ گونه استاندارد فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس رديابي کنند همچنين توانستند در گونه ا تيپيک فوزاريوم لانگستيه نيز ژن Tri۶ را شناسايي نمايند. اين ايزوله گونهاي از فوزاريوم بود که در مطالعات قبلي از غلات انباري شهرستان رباطکريم استان تهران جدا شده بود [۸] و مولد سم ۲-T بود. در حقيقت پرايمرهاي مورد استفاده توانستند گونههاي مهم مولد سم ۲-T را رديابي نمايند. کچويي و همکاران [۳۸] نيز با استفاده از پرايمرهاي طراحيشده براساس ژن Tri۳ توانستند گونههاي مهم مولد سم ۲-T را شناسايي و رديابي نمايند. در اين بررسي تمامي فوزاريومهاي مولد سم ۲-T واجد قطعه ژن Tri۶ و فوزاريومهاي غيرمولد فاقد قطعه ژن Tri۶ بودند. عدم وجود قطعه ژن Tri۶ در ۵۳ فوزاريوم پوي ه (8485 (MCR که مولد سم ۲-T نيست و وجود اين ژن در گونه فوزاريوم پوي ه (8486 (MCR که مولد سم ۲-T بهطور ضعيف است معرف اين مطلب است که پرايمرهاي استفادهشده در اين مطالعه توانستند علاوه بر گونههاي مهم مولد سم ۲-T گونههاي با توليد ضعيف سم ۲-T را نيز شناسايي نمايند. پرايمرهاي طراحيشده براساس ژن Tri۳ توسط کچوي ي و همکاران [۳۸] نتوانستند گونههاي با توليد ضعيف را شناسايي نمايند و مطالعه حاضر از اين جهت به بررسي قبلي برتري دارد. فوزاريوم پوي ه گونهاي است که بهندرت مولد سم ۲-T است. در بررسي پترسون و همکاران در سال ۹۹۵ روي ۷۴ ايزوله فوزاريوم پوي ه جداشده از ۰ کشور از نظر توليد سم ۲-T فقط يک ايزوله از هلند و ۲ ايزوله از دانمارک قادر به توليد سم ۲-T بودند [۳۹]. در مطالعه ديگر در سال ۹۹۸ روي ۲۲ ايزوله از نروژ هيچکدام از ايزولههاي فوزاريوم پوي ه قادر به توليد سم ۲-T نبودند [۴۰]. همچنين ۲ ايزوله فوزاريوم پوي ه تحت بررسي تورپ و لانگس ت در سال ۹۹۹ سم ۲-T را توليد نمیکردند [۲۳]. در مطالعه ديگر که توسط ماراسس و همکاران روي دو ايزوله فوزاريوم پوي ه روي ذرت انجام گرفت نشان داده شد که اين ايزولهها بهميزان کمي مولد سم ۲-T هستند [۴]. بررسيها نشان ميدهد که فقط يک مطالعه مشابه مطالعه حاضر روي ژن Tri۳ توسط کچوي ي و همکاران [۳۸] صورت گرفته است که در بالا به ا ن اشاره شد. مطالعات ديگر روي ديگر ژنهاي مسير بيوسنتز تريکوتسنها در فوزاريومهاي مختلف صورت گرفته است. نايسن و همکاران در سال ۲۰۰۴ بهمنظور طبقهبندي گونههاي مولد تريکوتسن در دسته اسپوروتريکيلا از ژن Tri۵ استفاده کردند. ا نها مشاهده نمودند که سکانس ژن Tri۵ در دو گونه فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس و فوزاريوم لانگستيه بسيار مشابه است و نميتوان پرايمري براساس اين ژن برای افتراق اين دو گونه طراحي نمود [۴۲]. در بررسي حاضر نيز سکانس ژن Tri۶ در ۳ گونه فوزاريوم اسپوروتريکيوي يدس فوزاريوم لانگستيه ا تيپيک و فوزاريوم پوي ه که مولد سم ۲-T بودند بسيار شبيه همديگر بود. مطالعه ديگري در ايران توسط هراتيان و همکاران در سال ۲۰۰۸ روي ژن Tri۳ در ايزولههاي جداشده از ايران که مولد تريکوتسنهاي نيوالنول و داکسينيوالنول بودند صورت گرفته است [۴۳]. در اين مطالعه روش مولکولي PCR برای شناسايي و رديابي سم ۲- T مورد استفاده قرار گرفت که هم مقرون به صرفه و هم ا سان و سريع است. بهطور کلي اين بررسي نشان داد که با استفاده از ژن Tri۶ و پرايمرهاي مورد استفاده ميتوان فوزاريومهاي مهم و گونههاي نادر مولد سم ۲-T را شناسايي و رديابي نمود. در بررسيهاي بعدي توصيه ميشود ايزولههاي بيشتري از گونههاي مولد ضعيف ۲-T مورد استفاده واقع شود. همچنين وجود اين ژن در مواد غذايي و غلات مشکوک به ا لودگي به سم ۲-T مورد بررسي قرار گيرد. نتيجهگيري با پروتکل مولکولی طراحیشده بر اساس ژن Tri۶ ميتوان گونههاي مهم مولد سم ۲-T مانند فوزاريوم اسپوروتريكيوي يدس و فوزاريوم لانگستيه را شناسايي کرد. همچنين ميتوان گونههايي از فوزاريوم كه بهطور ضعيف مولد ۲-T هستند را نيز شناسايي نمود. تشکر و قدرداني: اين مقاله استخراجشده از طرح پژوهشي مركز تحقيقات بيولوژي مولكولي است که با حمايت مالي معاونت تحقيقات و فناوري يکی از دانشگاههای علوم پزشکي نظامی شهر تهران در سال ۳۸۹-۹۰ انجام گرفته است. بر اين اساس از کليه مسي ولان امر کمال تشکر را داريم. همچنين از ا قاي دكتر سيد امير غياثيان كه اكثر سويههاي استاندارد را در اختيار اين تحقيق قرار دادند متشكريم. از همكاران در مركز تحقيقات بيولوژي مولكولي بهويژه از ا قاي دكتر Ir J Military Medicine Vol. 14, No. 1, Spring 2012

۵۴ محمدعلي عليخاني و همكاران Fusarium langsethiae species complex based on partial sequences of the translation elongation factor-1 alpha gene. Int J Food Microbiol. 2004;95(3):287-95. 20- Omurtag GZ, Yazicioglu D. Determination of T-2 toxin in grain and grain products by HPLC and TLC. J Inviron Sci Health. 2000;35(6):797-807. 21- Omurtag GZ, Yazicioglu D. Occurance of T-2 in processed cereals and pulses in turkey determine by HPLC and TLC. Food Addit Contam. 2001;18(9):844-9. 22- Langseth W, Rundberget T. Instrumental methods for determination of nonmacrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuffs and cultures. J Chroma A. 1998;815(1):103-26. 23- Torp M, Langseth W. Production of T-2 toxin by a Fusarium resembling Fusarium poae. Mycopathologia. 1999;147(2):89-96. 24- Pascale M, Haidukowski M, Visconti A. Determination of T-2 toxin in cereal grains by liquid chromatography with fluorescence detection after immunoaffinity column clean-up and derivatization with 1-anthroylnitrile. J Chroma A. 2003;989:257-64. 25- Mateo JJ, Mateo R, Jimenez M. Accumulation of type A trichothecene in maize, wheat and rice by Fusarium sporotrichioides isolates under diverse culture conditions. Int J Food Microbiol. 2002;72(1-2):115-23. 26- Riazipour M, Vatani H, Tavakoli HR, Mehrabi Tavana A, Afshari MA, Kachuei R, et al. Assessment of T-2 toxin in cereals served in centers of Tehran military earth force in winter 2007. Mil Med J. 2008;10(1):35-44. [Persian] 27- Russell R, Paterson M. Identification and quantification of mycotoxigenic fungi by PCR. Process Biochem. 2006;41:1467-74. 28- Jimenez M, Rodrıguez S, Mateo JJ, Gil JV, Mateo R. Characterization of Gibberella fujikuroi complex isolates by fumonisin B1 and B2 analysis and by RAPD and restriction analysis of PCR-amplified internal transcribed spacers of ribosomal DNA. System Appl Microbiol. 2000;23(4):546-55. 29- O Donnell K, Cigelnik E, Nirenberg HI. Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex. Mycology. 1998;90(3):465-93. 30- McCormick SP, Hohn TM, Desjardins AE. Isolation and characterization of Tri3, a gene encoding 15-Oacetyltransferase from Fusarium sporotrichioides. Appl Environ Microbiol. 1996;62(2):353-9. 31- Proctor RH, Hohn TM, McCormick SP, Desjardins AE. Tri6 encodes an unusual zinc finger protein involved in regulation of trichothecene biosynthesis in Fusarium sporotrichioides. Appl Environ Microbiol. 1995;61(5):1923-30. 32- Alexander NJ, Hohn TM, McCormick SP. The Tri11 gene of Fusarium sporotrichioides encodes a cytochrome p-450 monooxygenase required for C-15 hydroxylation in trichothecene biosynthesis. Appl Environ Microbiol. 1998;64(1):221-5. 33- Alexander NJ, McCormick SP, Hohn TM. Tri12, a trichothecene efflux pump from Fusarium sporotrichioides: Gene isolation and expression in yeast. Mol Gen Genet. 1999;261(6):977-84. 34- Mathison L, Soliday C, Stephan T, Aldrich T, Rambosek J. Cloning, characterization and use in strain improvement of the Cephalosporium acremonium gene cefg encoding acetyl transferase. Curr Genet. 1993;23(1):33-41. 35- Peplow AW, Meek IB, Wiles MC, Phillips TD, Beremand MN. Tri16 is required for esterification of position C-8 during trichothecene mycotoxin production by Fusarium sporotrichioides. Appl Environ Microbiol. 2003;69(10):5935-40. 36- Choi GH, Marek ET, Schardl CL, Richey MG, Chang S, علي نجفي كه در بحث بيوانفورماتيك اين بررسي همكاري داشتند نيز تشكر مينماييم. منابع 1- Allameh A, Razzaghi-Abyaneh M. Mycotoxins: Mycological, chemical and environmental aspects. Tehran: Emam Hossein University Publication; 2001. [Persian] 2- Ueno Y. Trichothecenes in food. In: Krogh P, editor. Mycotoxins in food. London: Academic Press; 1987. 3- Ler SG, Lee FK, Gopalakrishnakone P. Trends in detection of warfare agents detection methods for ricin, staphylococcal entrotoxin B and T-2 toxin. J Chroma. 2006;1133(1-2):1-12. 4- Joffe AZ. F. sporotrichioides as principal causal agents of alimentary toxic aleukia. In: Wyllie RD, Morehouse LG, editors. Mycotoxic Fungi, mycotoxins, mycotoxicoses an encyclopedic handbook. New York: Marcel Dekker; 1978. 5- Beardall JM, Miller JD. Diseases in humans with mycotoxins as possible causes. In: Miller JD, Trenholm HL, editors. Mycotoxins in grain: Compounds other than aflatoxin. St. Paul: Eagan Press; 1994. 6- Wang ZG, Feng JN, Tong Z. Human toxicosis caused by moldy rice contaminated with Fusarium and T-2 toxin. Biomed Environ Sci. 1993;6(1):65-70. 7- Ueno Y, Ishii K, Kanaeda S, Tsunoda H, Tanaka T, Enomoto M. Toxicological approaches to the metabolites of Fusaria. IV. Microbial survey on "bean-hulls poisoning of horses" with the isolation of toxic trichothecenes, neosolaniol and T-2 toxin of Fusarium solani M-1-1. Jpn J Exp Med. 1972;42(3):187-203. 8- Yazar S, Omurtag GZ. Fumonisins, Trichothecenes and Zearalenone in cereals. Int J Mol Sci. 2008;9(11):2062-90. 9- Joffe AZ. Toxic Fusarium species and varieties in nature and in laboratory conditions. Fusarium species: Their biology and toxicology. New York: Wiley Interscience; 1986. 10- Wannemacher RW, Wiener SL. Medical aspects of chemical and biological warfare. United States: United States Government Printing; 1997. 11- Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium laboratory manual. Oxford: Blackwell Publishing; 2006. 12- Torp M, Nirenberg HI. Fusarium langsethiae sp. nov on cereals in Europe. Int J Food Microbiol. 2004;95(3):247-56. 13- Torp M, Adler A. The European Sporotrichiella project: A polyphasic approach to the biology of a new Fusarium species. Int J Food Microbiol. 2004;95(3):241-5. 14- Infantino A, Pucci N, Conca G, Santori A. First report of Fusarium langsethiae on durum wheat kernels in Italy. Plant Dis. 2007;91(10):1362. 15- Lukanowski A, Lenc L, Sadowski C. First report on the occurrence of Fusarium langsethiae isolated from kernels in Poland. Plant Dis. 2008;92(3):488. 16- Hudec K, Rohacik T. The occurrence and predominance of Fusarium species on barley kernels in Slovakia. Cereal Res Commun. 2009;37(1):101-9. 17- Kachuei R, Yadegari MH, Rezaie S, Allameh A, Safaie N, Zaini F, et al. Investigation of stored mycoflora, reporting the Fusarium cf. langsethiae in three provinces of Iran during 2007. Ann Microbiol. 2009;59(2):383-90. 18- Kachuei R, Yadegari MH, Rezaie S, Allameh A, Safaie N, Zaini F. Isolation of Fusarium langsethiae and Fusarium sporotrichioides intermediate species and characterization of some morphological and molecular features of it. Mil Med J. 2009;11(2):103-8. [Persian] 19- Knutsen AK, Torp M, Holst-Jensen A. Phylogenetic analyses of the Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides and دوره ۴ شماره بهار ۳۹ مجله طب نظامي

۵۵ production and the relationship to vegetative compatibility groups in Fusarium poae. Chem Anal. 1998;140(2):105-14. 41- Cullen D. Mycotoxic Fusaria: Pathogenicity, cultural characteristics, taxonomy and genetics [dissertation]. Wisconsin: University of Wisconsin; 1981. 42- Niessen L, Schmidt H, Vogel RF. The use of Tri5 gene sequences for PCR detection and taxonomy of trichotheceneproducing species in the fusarium section sporotrichiella. Int J Food Microbiol. 2004;95(3):305-19. 43- Haratian M, Sharifnabi B, Alizadeh A, Safaie N. PCR analysis of the Tri13 gene to determine the genetic potential of Fusarium graminearum isolates from Iran to produce nivalenol and deoxynivalenol. Mycopathology. 2008;166(2):109-16. Smith DA. A stress-responsive gene in Fusarium spp. J Bacteriol. 1990;172(8):4522-8. 37- Rezaie S, Ban J, Mildner M, Poitschek C, Brna C, Tschachler E. Characterization of a cdna clone, encoding a 70 kda heat shock protein from the dermatophyte pathogen Trichophyton rubrum. Gene. 2000;241(1):27-33. 38- Kachuei R, Rezaie S, Yadegari MH, Allame A, Safaie N, Zaini F, et al. Evaluation of Fusarium isolates containing Tri3 gene for T-2 toxin production. Sari; Firth Iranian Congress of Medical Mycology, 2011. [Persian] 39- Pettersson H. Fusarium toxin research in Sweden. Braunschweig; German Mycotoxin Workshop, 1995. 40- Liu W, Sundheim L, Langseth W. Trichothecene Ir J Military Medicine Vol. 14, No. 1, Spring 2012